Tag Archive

Saat ini PCR atau polymerase chain reaction banyak disebut-sebut terutama karena dipakai sebagai metode diagnosis atau pelacakan penyakit Covid-19. Pada dasarnya PCR merupakan teknik duplikasi atau penyalinan materi DNA spesifik yang kita inginkan untuk disalin berulang-ulang untuk deteksi atau identifikasi keberadaan materi genetik tersebut pada sebuah sampel. Bagaimana sebenarnya prinsip atau langkah dari pemeriksaan ini? Berikut ulasannya. Sebelum dilanjutkan di bagian bawah, sebagai informasi bahwa selain dalam artikel ini, pembahasan mengenai mekanisme pemeriksaan PCR juga dapat disimak di video berikut ini: https://www.youtube.com/watch?v6rgM8_TwGxY Sejarah Singkat Pengembangan PCR PCR dianggap sebagai temuan yang merevolusi bukan hanya bidang ilmu biologi namun juga bidang turunannya yakni kedokteran. Bahkan dapat dikatakan bahwa teknik PCR membawa babak baru karena dapat membantu dalam deteksi materi genetik secara cepat sehingga bisa digunakan dalam metode diagnosis atau deteksi suatu penyakit. Hal ini terutama berkat kemampuan teknik PCR dalam memperbanyak sekuens asam nukleat target dari dari satu salinan menjadi ribuan sampai jutaan kali lipat dalam waktu yang singkat. Penemuan PCR ini tidak lepas dari peran Kary Mullis dimana pada awal dekade 1980-an memperoleh ide mengembangkan metode amplifikasi oligonukleotida secara cepat. Oligonukleotida adalah untaian pendek dari materi genetik yaitu DNA. Dengan amplifikasi bagian kecil tertentu dari DNA ini maka kita bisa mendeteksi adanya materi genetik tersebut dari sampel yang kita periksakan. Akan tetapi PCR tidak lahir begitu saja dari ide Kary Mullis. PCR muncul sebagai amalgamasi dari perkembangan dunia penelitian dan komponen-komponen yang sudah ada sebelumnya. Kary Mullis, penemu PCR, peraih hadiah Nobel Fisiologi/ Kedoteran tahun 1993 Penemuan Metode Replikasi Asam Nukleat Dimulai dengan penemuan struktur DNA pada tahun 1953 oleh Watson dan Crick, para ahli mencoba untuk memecahkan proses bagaimana asam nukleat bekerja dan digandakan di dalam sel. Pada tahun 1957, terjadi penemuan penting dimana untuk pertama kalinya ditemukan proses replikasi dan identifikasi enzim yang berperan dalam replikasi DNA yaitu DNA polimerase. Untuk lebih lanjut mengenai proses replikasi DNA ini dapat dipelajari di tautan ini. Setelah penemuan proses replikasi DNA ini, ilmuwan kemudian mencoba untuk menciptakan sistem atau metode replikasi ini agar dapat dilakukan di cawan petri. Tahun 1971, Kjell Kleppe dan ilmuwan peraih hadiah Nobel, Gobind Khorana, mempublikasikan deskripsi dan prinsip dari teknik replikasi asam nukleat di laboratorium melalui kutipan berikut: “… The DNA duplex would be denatured to form single strands. This denaturation step would be carried out in the presence of a sufficiently large excess of the two appropriate primers. Upon cooling, one would hope to obtain two structures, each containing the full length of the template strand appropriately complexed with the primer. DNA polymerase will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the original duplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added every time a fresh dose of the enzyme. It is however, possible that upon cooling after denaturation of the DNA duplex, renaturation to form the original duplex would predominate over the template-primer complex formation. If this tendency could not be circumvented by adjusting the concentrations of the primers, clearly one would have to resort to the separation of the strands and then carry out repair replication. After every cycle of repair replication, the process of strand separation would have to be repeated.”Kjell Kleppe dan Gobind Khorana, 1971 Kjell Kleppe (kiri) dan Gobind Khorana (kanan) Dari kutipan di atas tampak bahwa apa yang dikemukakan merupakan deskripsi dari proses yang sekarang dikenal sebagai PCR. Jadi prinsip PCR sudah diketahui jauh sebelumnya era 1980-an. Namun, metode tersebut pada saat dipublikasikan belum atau tidak dapat diverifiaksi secara eksperimen. Menciptakan sistem duplikasi tersebut masih mustahil. Terdapat beberapa hambatan. Pertama, informasi sekuens primer yang dibutuhkan saat itu tidak ada dan kedua, belum ada cara untuk memproduksi primer oligonuleotida sintetik secara mudah. Nah, untuk menggambarkan proses yang dikemukakan oleh Kleppe dan Khorana di atas dapat memperhatikan bagan proses duplikasi di bawah ini: Konsep proses sintesis DNA yang dikemukakan Kjell Kleppe dan Gobind Khorana Penemuan Metode Sekuensing DNA Chain Termination oleh Frederick Sanger Terobosan kemudian muncul setelah ditemukakannya metode untuk mengetahui urutan basa dari DNA yang dimiliki makhluk hidup. Langkah atau metode untuk mengetahui urutan basa DNA tersebut dinamakan sekuensing DNA. Tahun 1964, Richard Howley mengemukakan prinsip metode atau cara melakukan sekuensing terhadap RNA. Adapun untuk metode sekuensing DNA baru bisa dilakukan setelah tahun 1977 dimana di tahun tersebut Frederick Sanger memperkenalkan teknik sekuensing DNA dengan memakai metode chain termination yang merupakan teknik yang dipakai sampai saat ini. Frederick Sanger. Perain dua hadiah Nobel bidang kimia yaitu tahun 1958 atau penelitian struktur hormon insulin dan 1980 atas temuan metode sekuensing DNA. Untuk metode chain termination ini secara singkat dapat disimak di bagan di bawah ini: Skema sederhana sekuensing DNA menurut Frederick Sanger. Dengan adanya teknik sekuensing ini, kita akhirnya bisa mengetahui urutan basa DNA dari sampel yang ingin kita teliti. Dari sini, memungkinkan untuk dibuat desain primer DNA untuk dibuat dan dipakai dalam metode amplifikasi sampel DNA yang kita inginkan. Karena jasanya yang besar dalam menemukan teknik sekuensing DNA, Frederick Sanger kemudian dianugerahi hadiah Nobel bidang kimia. Penemuan Taq DNA Polimerase Temuan PCR juga dipermudah dengan ditemukannya Taq DNA polimerase. Pada tahun 1976 para peneliti berhasil menemukan Taq DNA polimerase yang merupakan enzim DNA polimerase yang berasal dari bakteri Thermus aquaticus. Bakteri ini merupakan bakteri unik yang merupakan spesies bakteri yang bisa hidup di tempat dengan suhu tinggi. Bakteri ini dapat berahan hidup di lingkungan dengan suhu 50°C sampai 80°C. Salah satu hal yang istimewa dari sifat Taq DNA polimerase ini karena protein ini memiliki sifat tahan panas atau dapat bekerja di lingkungan dengan suhu tinggi. Bakteri Thermus aquaticus, asal penemuan dari Taq DNA polimerase Apa hubungannya Taq DNA polimerase dengan metode PCR? Seperti yang akan dijelaskan lebih detil nanti, pada setiap siklus PCR akan dilakukan pemanasan sampel sampai suhu 94°C. Pada PCR, enzim DNA polimerase diperlukan untuk replikasi sampel DNA yang dikehendaki. Di awal PCR dikembangkan, dipakai DNA polimerase dari E. coli. Namun, dengan pemanasan sampai suhu tinggi saar PCR menyebabkan kerusakan DNA polimerase sehingga pada awal tiap siklus harus ditambahkan DNA polimerase yang baru. Tetapi, dengan adanya Taq DNA polimerase, tidak perlu lagi ditambahkan DNA polimerase baru sehingga siklus PCR dapat berjalan secara terotomatisasi. Ide Kary Mullis Dengan memodifikasi metode Sanger, pada era 1980-an, proses penggandaan DNA dengan memanfaatkan primer DNA serta DNA polimerase sudah menjadi metode yang umum digunakan. Adapun ide unik yang dibawa Kary Mullis adalah dengan memanfaatkan dua primer oligonukletida jukstaposisi yang saling berkomplementer satu sama lain kemudian melakukan anplifikasi segmen DNA yang berada diantara dua posisi primer tadi serta membuat reaksi penyalinan ini terjadi secara repetitif dan nukleotida yang baru juga akan menjadi template bagi reaksi berikutnya sehingga terjadi reaksi berantai. Atas penemuan dan ide ini, Kary Mullis kemudian dianugerahi hadiah Nobel bidang Fisiologi/Kedokteran tahun 1993. Bagaimana Prinsip Kerja PCR? Seperti dijelaskan sebelumnya, PCR merupakan proses enzimatik yang memproses segmen atau regio DNA tertentu dan menyalinnya terus-menerus sehingga diperoleh banyak salinan dari segmen DNA yang kita kehendaki. PCR bekerja mirip dengan reaksi replikasi DNA. Hanya saja, reaksi PCR dijalankan di tabung reaksi yang mengandung sampel dan bahan reaktan dan dimasukan ke dalam mesin yang mengatur suhu sesuai tahapan PCR. PCR pada dasarnya menyalin DNA yang dikehendaki melalui reaksi enzimatik. Metode PCR mampu menyalin satu salinan DNA target yang awalnya tidak terdeteksi menjadi sampai puluhan juta salinan atau lebih dalam waktu singkat. Dengan menggandakan DNA target tersebut pada akhirnya dari awalnya tidak terdeteksi menjadi dapat terlihat atau terdeteksi. Standar Bahan PCR Pada satu tabung bahan yang digunakan pada PCR adalah sebagai berikut: Sampel atau bahan yang diperiksaPrimer spesifik dan ada dua jenis yaitu forward primer dan reverse primer.Enzim DNA polimerase yang tahan panas (Taq DNA polimerase)dNTP yaitu empat jenis nukleotida DNA (adenin/dATP, sitidin/dCTP, guanin/dGTP, dan timidin/dTTP)Garam mineral dan elektrolit sebagai buffer untuk memperoleh lingkungan yang sesuai agar enzim dapat bekerja secara efektif dan juga sebagai kofaktor enzim DNA polimerase.Thermac cycler, alat yang mengatur suhu sampel. Nanti dijelaskan bahwa setiap tahap pada siklus PCR memerlukan temperatur tertentu. Pada tabel di bawah diperlihatkan keperluan jumlah untuk masing-masing reaktan. ReaktanVolumeBuffer PCR 10X5 μLPrimer forward1 μLPrimer reverse1 μLCampuran dNTP (10 mM)2,5 μLTaq DNA polimerase0,5 μLAir yang dimurnikansampai 50 μLMgCl2 25 mM3 μL Adapun untuk peralatan PCR seperti terlihat di bawah ini dimana terdapat tabung steril berbagai ukuran dan thermocycler yang bekerja menyeting suhu sampel serta melakukan siklus PCR secara terotomatisasi. Alat untuk PCR. Kiri, tabung steril: (1) 1,8 mL; (2) 0,2 mL; (3) 0,2 mL. Kanan adalah thermocycler, peralatan dapat beragam sesuai produsen. Apa Saja Tahapan atau Siklus dari PCR? Tahapan utama PCR ada tiga yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi/terminasi. Ketiga tahap PCR ini berjalan biasanya dalam 25-30 siklus. Adapun penjelasan lebih detil untuk tiap tahap ini adalah sebagai berikut: Tahap 1: Denaturasi Pada tahap ini, DNA sampel yang membentuk struktur double helix atau heliks ganda akan dipisah membentuk struktur single strand. Apabila pada replikasi alami proses ini dilakukan oleh enzim helikase, maka pada PCR proses denaturasi dilakukan dengan cara fisika yakni memanaskan sampel. Tahap denaturasi dengan pemanasan pada proses PCR Untuk tahapan denaturasi ini, sampel biasanya dipanaskan sampai suhu 98°C selama 10 detik. Seperti dijelaskan sebelumnya, apabila menggunakan DNA polimerase biasa, maka penambahannya harus dilakukan setelah proses denaturasi karena jika turut dipanaskan, maka DNA polimerase akan rusak. Namun, dengan adanya Taq DNA polimerase, penambahan enzim bisa dilakukan di awal reaksi PCR. Dengan terbukanya struktur heliks ganda ini maka akan memungkinkan tahapan PCR berikutnya yaitu annealing. Tahap 2: Annealing Proses selanjutnya adalah annealing atau penempelan DNA primer. Untuk proses ini, suhu sampel akan diturunkan ke 60°C. Proses annealing ini hanya berlangsung selama 30 detik. Dengan menempelnya primer ini, maka DNA polimerase dapat menempel dan bisa memulai reaksi berikutnya. Tahapan annealing PCR Tahap 3: Ekstensi/Terminasi Setelah pada annealing primer menempel, maka selanjutnya adalah tahap ekstensi atau penyalinan DNA yang baru. Agar optimal, pada tahapan ini suhu kembali dinaikan menjadi 72°C. Pada suhu tersebut, dapat diperoleh kecepatan elongasi sebesar 1000 pasang basa per menit. Biasanya proses esktensi PCR ini berlangsung dalam waktu 10 menit. Setelah itu proses akan dihentikan dengan menurunkan suhu sampel sampai 4°C. Tahap elongasi PCR Setelah proses ekstensi selesai, maka siklus PCR akan dimulai kembali ke tahap denaturasi. Siklus ini berlangsung sekitar 25-30 kali siklus. Dengan pengulangan siklus ini, dapat dilakukan penyalinan DNA sampel berjuta-juta kali dalam waktu yang relatif singkat. Apalagi saat ini proses siklus PCR dapat dilakukan secara terotomatisasi. Rangkuman satu siklus PCR Analisa Hasil PCR Setelah dilakukan kloning atau penyalinan segmen dari sampel DNA yang kita periksa, langkah lanjutan adalah melakukan analisis dari hasil penyalinan tersebut. Pada saat awal, sampel yang telah melalui siklus PCR akan dianalisa melalui proses elektroforesa. Dengan perkembangan alat seperti thermocycler, analisis hasil PCR dapat dilakukan bersamaan dengan proses penyalinan. Perbedaan dan perbandingan keduanya akan dijelaskan pada segmen berikut ini: Elektroforesa Hasil PCR Elektroforesa adalah teknik memisahkan atau fraksinasi molekul pada suatu media dengan memberi aliran listrik pada cairan tempat molekul terlarut sehingga terjadi pergerakan dan pemisahan fraksi molekul berdasarkan perbedaan kecepatan gerak molekul yang tergantung dari berat molekul tersebut. Semakin kecil molekul, maka akan semakin cepat molekul tersebut bergerak. Akibatnya, molekul kecil akan terpisah dari molekul yang lebih besar. Alat elektroforesa Dengan elektroforesa, kita bisa mengidentifikasi untaian DNA yang kita coba salin. Dengan sebelumnya mengetahui sekuens bagian DNA yang kita salin, kita bisa menentukan berat molekul DNA dan mengetahui apakah di dalam sampel tersebut ada untaian DNA yang kita coba identifikasi. Di bawah ini adalah gambar prinsip teknik elektroforesa. Perlu diingat bahwa elektroforesa ini juga lazim dipakai untuk teknik identifikasi molekul lain selain dari PCR misalnya protein. Bagan cara pemeriksaan elektroforesa Nah, dengan elektroforesa ini kita bisa mengetahui apakah pada sampel yang kita oleh dengan metode PCR mengandung segmen DNA yang ingin kita cari. Adapun contoh hasil elektroforesa pada PCR bisa dilihat di gambar di bawah ini: Contoh elektroforesa sampel PCR. P artinya kontrol positif, M adalah tempat petanda berat molekul, W adalah kontrol negatif (water), dan diantaranya terdapat 16 sampel dengan 6 sampel menunjukan hasil positif. Real-Time PCR Kelemahan terbesar dari analisis hasil PCR dengan elektroforesa adalah menambah waktu pemeriksaan dan juga hasilnya berupa kualitatif, menyatakan hasil positif atau negatif saja. Metode real-time PCR mencoba mengatasi kelemahan pada metode elektroforesa. Dasar dari real-time PCR adalah penggunaan molekul petanda atau beacon pada reaktan. Fungsi molekul petanda ini adalah memberi sinyal akan keberadaan salinan DNA hasil dari reaksi polimerase. Molekul petanda ini akan bereaksi dengan salinan DNA beruapa reaksi fluoresensi dan saat bereaksi maka molekul petanda ini akan melepaskan foton atau sinar. Sinar ini kemudian dapat ditangkap oleh detektor di dalam mesin. Adanya teknik ini memungkinkan beberapa hal: Mengamati hasil polimerase secara real-time Mendapatkan hasil lebih cepat karena tidak memerlukan penambahan tahap dan ketika hasil sudah menyatakan positif maka siklus dapat dihentikan tidak menunggu harus mencapai penuh 25-30 siklusMemungkinkan kuantifikasi perkiraan jumlah salinan awal dari sampel Jenis molekul petanda yang digunakan pada real-time PCR Kuantifikasi ini memungkinkan kita mengetahui berapa jumlah salinan awal dari DNA di dalam sampel awal. Baik itu menhitung dalam satuan salinan atau IU maupun dalam bentuk cycle threshold value (Ct-value). Ct-value ini adalah jumlah siklus saat dimana sinyal yang ada dapat diinterpretasikan sebagai hasil positif. Semakin kecil CT-value berarti jumlah salinan gen yang kita periksa semakin besar. Grafik plot data pada real-time PCR. Baseline merupakan sinyal fluoresens yang berakumulasi namun masih di bawah kemampuan deteksi instrumen. ΔRn adalah peningkatan sinyal fluoresens yang diplot terhadap jumlah siklus. Ct adalah fraksi jumlah siklus PCR saat sinyal fluoresens melewati ambang batas atau threshold. Dalam hal pemeriksaan PCR kasus Covid-19, Ct-value dapat memberi informasi mengenai banyaknya virus yang ada di sampel atau penderita. Semakin rendah Ct-value berarti jumlah virus yang ada dalam sampel semakin banyak yang berarti bahwa orang yang kita periksa memiliki beban virus yang tinggi. Modifikasi dan Pengembangan PCR Sampai saat ini telah banyak dilakukan modifikasi maupun pengemangan dari metode PCT awal yang dikemukakan Kary Mullis. Beberapa diantaranya adalah sebagai berikut: Pengembangan Hot Starting Polymerase Seperti disebutkan di atas, adanya Taq DNA polimerase sangat membantu pengembangan sistem reaksi PCR. Namun, bukan berarti enzim ini sempurna. Taq DNA polimerase tidak stabil di suhu tinggi, lebih cenderung membuat kesalahan penyalinan DNA, dan kesulitan menyalin segmen DNA yang banyak mengandung nukleotida GC atau dengan struktur sekunder yang kuat. Faktor-faktor tersebut cukup membuat kesulitan pada fase awal pengembangan PCR terutama pada kondisi dimana dibutuhkan spesivisitas dan kehandalan yang tinggu. Sampai di sini jelas bahwa untuk pengembangan PCR lebih lanjut memerlukan adanya DNA polimerase yang lebih baik.Di akhir dekade 1980-an bermunculan teknik dengan menggunakan metode "hot start" untuk mengatasi inefisiensi dan spesivisitas yang rendah dari Taq DNA polimerase pada suhu tinggu. Teknik "hot-start" ini meliputi pemnasan reaksi PCR sampai 95°C dan kemudian diturunkan kembali menjadi 60–70°C. Walaupun cukup efektif, teknik ini memakan waktu cukup dan sering menyebabkan kontaminasi sampel. Pfu DNA Polimerase Pada tahun 1991 dikembangkan penggunaan dari Pfu DNA polimerase. Pfu DNA polimerase merupakan DNA polimerase yang berasal dari Pyrococcus furiosus. DNA polimerase ini memiliki aktivitas proofreading eksonuklease. Artinya, enzim ini dapat mengenali kesalahan penyalinan DNA dan memperbaiki kesalahan tersebut. Keunggulannya tentu mengurangi kesalahan proses penyalinan yang tidak dimiliki oleh Taq DNA polimerase. Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR) Kita tahu bahwa selain DNA, materi genetik lain yang ada dalam tubuh adalah RNA. RT-PCR bekerja untuk mendeteksi dan menyalin RNA. Metode penyalinan sama dengan PCR biasa. Bedanya adalah pada tahap awal, RNA terlebih dahulu ditranskripsi terbalik menjadi DNA terlebih dahulu oleh enzim reverse transcriptase. DNA yang dihasilkan kemudian diamplifikasi oleh siklus PCR seperti biasa. Proses dasar RT-PCR RT-PCR digunakan dalam bidang penelitian genetik dan infeksi. Pada penelitian genetik, pemeriksaan ini dipakai untuk mendeteksi adanya mRNA. mRNA merupakan produk dari ekspresi gen. Dengan deteksi molekul tersebut, kita dapat melihat begaimana aktivitas ekspresi gen dari jaringan atau bahkan sel tunggal. Adapun pada bidang infeksi, RT-PCR banya digunakan untuk mendeteksi virus jenis RNA dimana materi genetik yang ada dalam virion berupa RNA seperti pada kasus Covid-19. Intelligent Design Di tahun 2003 diperkenalkan DNA polimerase fusi atau gabungan yang merupakan cara untuk mengatasi kelemahan dari Taq DNA polimerase. DNA polimerase fusi ini diciptakan dari komponen inti polimerase Archaea dengan domain DNA-binding yang stabil dalam kondisi temperatur tinggi. Hasilnya adalah DNA polimerase yang sangat stabil pada suhu tinggi namun juga memiliki kemampuan editing dan proofreading yang baik. Selain itu, dengan menggunakan domain DNA-binding tertentu, dapat meningkatkan afinitas DNA polimerase terhadap double-stranded DNA berkali-kali lipat. Pengembangan DNA polimerase baru ini ditambah dengan teknologi real-time serta PCR digital semakin melebarkan sayap peran pemeriksaan PCR dalam berbagai jenis teknologi penelitian biologi, kedokteran, dan praktis kesehatan. Penggunaan PCR Dengan menggandakan DNA target maka pemeriksaan PCR ini dapat digunakan untuk tujuan: Penanganan penyakit, yaitu melihat apakah salinan spesifik suatu gen, DNA bakteri, DNA virus berada dalam sampel yang kita periksa. Misalkan pada penyakit Covid-19, jika dalam sampel terdapat materi genetik virus SARS-CoV-2, maka dengan PCR materi genetik bisa digandakan sehingga menjadi terdeteksi. Dengan terdeteksinya virus tersebut maka diagnosis penyakit Covid-19 ditegakanPemeriksaan bahan makanan. Misalnya saja mendeteksi makanan atau obat yang menggunakan bahan atau turunan dari babiPenelitian biologi dan kedokteran. Tentu dengan adanya PCR kita dapat melakukan penelitian mulai dari deteksi gen tertentu, identifikasi aktivitas ekspresi gen dengan deteksi mRNA, dan lain sebagainya Kesimpulan Tidak diragukan lagi bahwa PCR telah membawa dampak besar baik dari segi penelitian maupun sisi praktis khususnya bidang kedokteran. Miniaturisasi dan penyempurnaan teknik PCR saat ini memungkinkan alat pemeriksaan semakin ringkas, semakin mudah digunakan, dan semakin terjangkau dari segi biaya. Khusus pada masa pandemi Covid-19 ini, tidak terbayangkan bagaimana penanganan pandemi jika tidak ada teknologi PCR ini. Oleh sebab itu, tidak salah kalau PCR adalah salah satu teknologi terobosan terpenting di bidang sains kedokteran pada masa modern ini. Referensi Bachman J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). 1st ed. Vol. 530, Methods in Enzymology. Elsevier Inc.; 2013. 67–74 p.Bartlett JMS, Stirling D. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: PCR Protocols. New Jersey: Humana Press; 2000. p. 3–6.Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW. Quantitative real-time RT-PCR - A perspective. J Mol Endocrinol. 2005;34(3):597–601.Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol Rev. 2006 Jan;19(1):165–256.Garibyan L, Avashia N. Polymerase Chain Reaction. J Invest Dermatol. 2013 Mar 24;133(3):1–4.Lorenz TC. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012;(63):1–15.Navarro E, Serrano-Heras G, Castaño MJ, Solera J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 2015;439:231–50.